γ-氨基丁酸（GABA）为人体中枢神经系统内重要的抑制性神经递质。在GABA能神经元中，当突触前膜去极化后，内含GABA的突触囊泡将融合到突触前膜，并释放GABA到突触间隙中。随后，GABA会结合突触后膜的GABAA受体，引发Cl-内流，使得突触后膜超极化，从而抑制神经冲动的传递。GABA转运体1（GAT1）负责将突触间隙的GABA回收至突触前膜神经元，从而调控下游受体的激活状态。GAT1维持着神经系统抑制微环路的稳定，其功能异常会导致多种神经类疾病，比如自闭症、癫痫、精神分裂症。GAT1是重要的抗癫痫靶点，通过阻断GAT1的功能可以抑制突触间隙中GABA的清除，进而减少神经冲动以减轻癫痫症状。1997年，美国FDA批准GAT1抑制剂噻加宾作为辅助治疗的癫痫的药物。此前Gati组在2022年报道了GAT1结合噻加宾的3.8埃的电镜结构[1]，但是目前仍然缺乏高分辨率的结构信息来揭示GAT1对小分子底物GABA的识别和转运机制以及其它抑制剂如3-哌啶甲酸的抑制机制。
2023年7月3日，金沙js4399首页副教授闫创业课题组在自然-结构与分子生物学（Nature Structural & Molecular Biology）发布了关于GABA转运体GAT1的转运与抑制机制的重要成果。该工作通过结构生物学和生物化学相结合的手段阐明GAT1转运底物GABA的机制，揭示了竞争性抑制剂3-哌啶甲酸和非竞争性抑制剂抗癫痫药物噻加宾的抑制机制，为进一步靶向GATs的药物奠定了基础。
在本篇文章中报道了GAT1在无底物、结合内源底物GABA、竞争性抑制剂3-哌啶甲酸和非竞争性抑制剂抗癫痫药物噻加宾四种不同的结构，分辨率为2.2～3.2埃。其中无底物结合与结合噻加宾的结构为向内开口（inward-open）状态，结合内源底物GABA和竞争性抑制剂3-哌啶甲酸的结构为向内阻塞（inward-occluded）状态（图1）。
图1 GAT1在无底物状态及结合三种配体的结构
低分子量膜蛋白解析在冷冻电镜领域较为困难，一般需要较大可溶区或者纳米抗体的帮助。在此前闫创业课题组成功解析具有柔性可溶区的单羧酸转运体MCT1/Basigin-2复合物（3.0埃）[2]和无可溶区的葡萄糖转运体GLUT4（3.2埃）[3]的高分辨率三维结构。在这项工作中，研究人员在没有纳米抗体的条件下，进一步获得了2.2至2.4埃高分辨率的无底物结合和结合底物GABA的GAT1结构。
得益于高分辨率的电镜密度图，研究人员可以准确地将GABA、3-哌啶甲酸和噻加宾搭建出来（图2），同时在结构中也能清楚地观测到钠离子、氯离子和水分子。GABA和3-哌啶甲酸的羧基可以与钠离子、残基G65和Y140相互作用，而它们的氮原子可以与周围的水相互作用。通过对这些配体与GAT1的相互作用模式的分析，该研究提供了有关GAT1识别和转运底物以及抑制机制的重要见解。这项研究为进一步开发针对GATs的治疗神经疾病的药物提供了有价值的设计思路。
图2 GAT1与GABA、3-哌啶甲酸和噻加宾的互作模式
金沙js4399首页副教授闫创业和助理研究员袁亚飞为共同通讯作者；2019级博士生朱盎岐为本文的第一作者；2022级博士生黄隽豪、2021级博士生孔方和2019级博士生谭佳鑫对本研究提供了重要帮助；金沙js4399首页冷冻电镜平台主管雷建林博士为冷冻电镜数据收集提供了帮助。
实验的电镜数据采集受到金沙js4399首页冷冻电镜平台的支持，实验的计算工作得到金沙js4399首页高性能计算平台、国家蛋白质设施实验技术中心（北京）的支持。本研究获得了国家自然科学基金重点研发计划、膜生物学国家重点实验室、北京市科技新星计划、北京高校卓越青年科学家计划项目、北京生物结构前沿研究中心与清华-北大生命科学联合中心的经费支持。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41594-023-00983-z
参考文献：
[1] Motiwala, Z. et al. Structural basis of GABA reuptake inhibition. Nature 606, 820–826 (2022).
[2] Wang, N. et al. Structural basis of human monocarboxylate transporter 1 inhibition by anti-cancer drug candidates. Cell 184, 370–383.e13 (2021).
[3] Yuan, Y. et al. Cryo-EM structure of human glucose transporter GLUT4. Nat. Commun. 13, 2671 (2022).
